我的WB又沒有雜出來，太桑心了”
“你的WB又沒有雜出來，用掉多少抗體了，還買進(jìn)口的！”
“你的WB又沒有雜出來，我等到黃花都謝了！”
·······
WB磷酸化蛋白曝不出條帶的時候，以上幾乎是所有人的心理獨白。磷酸化抗體的使用一直是許多人關(guān)心的重點，為了讓大家少走彎路，專業(yè)的CST中國技術(shù)團隊總結(jié)了部分常見問題，一一為大家解答，希望能助同道中人一臂之力，早日出結(jié)果發(fā)paper, 為社會人民造福利！
CST賽信通關(guān)于磷酸化抗體Autophagy Signaling信號通路圖
1.確定樣本中磷酸化蛋白的表達(dá)量
①對的樣本，②正確的處理方法和③合適的陽性對照是實驗成功的第一步。①實驗前需先查閱文獻(xiàn)或通過預(yù)實驗檢測該樣本是否表達(dá)，若該樣本根本就不表達(dá)目的蛋白，那就不要浪費感情了吧；②若正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達(dá)，可通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)，刺激條件各不相同。但這并不代表刺激越多越好，充分但不過分（如磷酸化IRS1，僅需刺激5min，刺激過久會進(jìn)入負(fù)反饋機制進(jìn)而開始降解）的正確刺激會幫助得到最佳實驗結(jié)果；③有合適的陽性對照至關(guān)重要，在任何實驗中，我們都應(yīng)考慮包含適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ?，進(jìn)一步確定抗體檢測到的特異性信號。
2.總蛋白和內(nèi)參對照都要做
普通的內(nèi)參如Actin、GAPDH等和總蛋白抗體的對照都要做嗎？對，都要做！普通內(nèi)參可以作為體系的對照，保證上樣量一致從而排除體系本身的影響，對于結(jié)果分析比對十分重要。同時，總蛋白抗體也必不可少，僅僅是檢測到磷酸化蛋白表達(dá)量的增加并不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加了才能說明磷酸化水平增加，這種表述實驗結(jié)果的方法是最客觀的，也是必需的。
CST賽信通關(guān)于磷酸化抗體Phosphoinositide Signaling信號通路圖
3.確保完全裂解并使用新鮮樣本
相對于僅用裂解緩沖液裂解，裂解液裂解+超聲處理可確保整個細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì)DNA。建議在35%-40%的功率輸出條件下超聲3次，每次10s。由于不同儀器不同性能，請根據(jù)生產(chǎn)商的建議進(jìn)行優(yōu)化。超聲處理時應(yīng)保持低溫，冰上操作。如果沒有探頭超聲儀，用細(xì)的注射器針頭反復(fù)吹打也能起到類似的作用。在得到樣品后，請不要反復(fù)凍融，建議-80℃冰箱分裝保存。
4.小心蛋白殺手
組織或細(xì)胞裂解時會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，非常重要。否則條帶很淺不說，結(jié)果可信度還不能保證。注意：PMSF#8553 要新鮮配置。
CST賽信通關(guān)于磷酸化抗體MAP Kinase Signaling信號通路圖
5.樣品低溫處理
除超聲時保持低溫，在做磷酸化蛋白的整個實驗過程中都要保證低溫環(huán)境。磷酸化蛋白在室溫條件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制劑也很明顯。所以務(wù)必要保持！低溫！環(huán)境！
6.用5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1h
網(wǎng)絡(luò)上流傳的磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說法是沒有科學(xué)依據(jù)的。這一誤區(qū)的出現(xiàn)可能是由于實驗者使用了非實驗級奶粉引起的（國內(nèi)許多奶粉含有磷酸酶等雜質(zhì)）。CST建議轉(zhuǎn)膜后迅速在TBS中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液，隨后使用5%脫脂牛奶（請使用實驗級的#9999）的TBST室溫封閉1h，這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。另外應(yīng)避免膜封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。CST建議所有抗體均應(yīng)如此。CST科學(xué)家生產(chǎn)驗證每一支上市的抗體的每一種應(yīng)用，顯然更懂得如何讓抗體表現(xiàn)出最佳的狀態(tài)。封閉完后，孵育一抗前最好在TBST中洗滌5min。
7.一抗稀釋液
請務(wù)必根據(jù)產(chǎn)品說明書中推薦的稀釋液稀釋一抗，不同產(chǎn)品有不同最佳稀釋液，采用CST推薦的一抗稀釋液并按標(biāo)準(zhǔn)protocol 操作實驗，是實驗成功的保證。
8.4℃條件過夜孵育一抗
抗原抗體之間是一種非共價的結(jié)合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會變?nèi)?，容易脫落，因此，首先保證4℃抗體孵育條件非常重要。其次要保證抗原和抗體相互磨合孵育的時間，磷酸化蛋白只占總量的極少部分，過夜可保證充分結(jié)合進(jìn)而曝出更漂亮的條帶。哪怕不是磷酸化蛋白，CST也推薦4℃過夜孵育，讓結(jié)果呈現(xiàn)最好的一面。
9.洗膜條件
一抗和二抗均建議用1*TBST （相對于PBST緩沖液，最終信號會更強）洗膜3次，每次5min。洗膜時間不宜過長或過短，過長會導(dǎo)致信號減弱（抗體從結(jié)合的位點脫落），過短則會導(dǎo)致背景深。另外，洗膜的時候，盒子要比膜稍微大一圈，保證膜充分的在洗滌液中晃動，且建議單張洗膜而非幾張一起清洗。
10.二抗室溫1h孵育
用5%牛奶的1*TBST稀釋的二抗（BSA稀釋二抗會產(chǎn)生較高背景），室溫1h孵育即可。
11.掌控好曝光或壓片時間
磷酸化蛋白檢測除了容易有雜帶外，還容易出現(xiàn)高背景。所以曝光或壓片的時候注意掌控好時間，時間太長會使得背景深，過短又會不容易曝出條帶或曝出條帶很淺，所以需要優(yōu)化出適合自己靶蛋白和實驗體系的最佳曝光時間。
12.磷酸化和總蛋白抗體到底怎么孵育？
一般磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，所以如果樣品比較珍貴或有限的情況下，可以在壓完磷酸化抗體后，將膜strip后再壓總蛋白抗體，stripping的時候注意溫度盡量控制在50℃以內(nèi)。不過CST的做法是建議在樣品充足的情況下同時跑兩塊膠，比strip效果會更好。
CST賽信通關(guān)于磷酸化抗體p53 Signaling信號通路圖
13.蛋白Marker很重要！
做磷酸化蛋白WB時，除了目的蛋白的條帶外，還可能會出現(xiàn)一些非特異性條帶。所以在此情況下，請一定要根據(jù)marker大小進(jìn)行比對，查看條帶的分子量。否則有可能會誤以為一些非特異條帶是自己想要的，分析半天走了冤枉路不說，還耗費了大量精力。
除了謹(jǐn)記以上步驟外，最重要的當(dāng)然還是要選擇質(zhì)量過硬的抗體！
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